【转自中国科学院微生物所】S-普瑞巴林是γ-氨基丁酸的结构类似物，作为镇痛、抗惊厥和抗焦虑药物广泛应用于临床治疗。S-普瑞巴林药物在口服后迅速被人体吸收并主动转运到大脑中，因此与其他γ-氨基丁酸类药物相比，S-普瑞巴林的疗效更佳。目前S-普瑞巴林规模化生产工艺是利用2-氰基乙酰胺和异戊醛合成环亚胺，然后碱水解获得混消旋的R/S-单酰胺，进一步在氯仿溶液中使用R-(+)-1-苯乙胺进行化学拆分获得手性中间体R-单酰胺，最后经Hofmann重排反应合成S-普瑞巴林。化学拆分步骤需要使用大量的有机溶剂，污染重、周期长、收率低，开发S-普瑞巴林的绿色合成工艺成为产业需求。
为降低环境污染，推进产业绿色发展，中科院微生物所于波研究组针对S-普瑞巴林化学工艺路线中污染严重、效率较低的R-单酰胺化学拆分步骤，开发了一步酶法手性合成R-单酰胺的技术工艺。依据底物相似性，对数据库中的酶资源进行了大量筛选，发现来自嗜热脂肪芽孢杆菌的D-苯海因酶（BsHase）具有催化环亚胺合成单酰胺的活性，但初始获得的R-单酰胺手性值eep仅为38.9%。随后科研人员对BsHase进行了理性设计和改造。分子对接模型显示，BsHase可攻击环亚胺的C10原子产生R-异构体，也可攻击C9原子产生S-异构体，活性口袋附近的三个残基Met63、Leu65和Cys317是影响底物结合的关键位点。科研人员对这三个位点进行多轮组合突变，获得的三突变体酶实现了催化环亚胺合成高手性纯度的R-单酰胺。BsHase突变体允许底物疏水异丁基基团向突变氨基酸残基方向伸展，使得用于亲核进攻的水分子中氧原子更易接近底物环亚胺的C10原子，远离C9原子，因此提高了R型产物的得率。
采用全细胞催化工艺，开发的生物催化剂可将0.5 M环亚胺全部转化为R-单酰胺，代表手性纯度的eep值达到99.8%。为进一步简化过程，测试了原位发酵-转化工艺，在7 L发酵罐上，高细胞密度发酵液中的环亚胺直接投料浓度为0.9 M（> 150 g/L），产物R-单酰胺对环亚胺的摩尔转化率超过99.0%（质量得率1.07 g/g），手性值eep达到99.8%。经过菌液分离、活性炭脱色、酸化沉淀和干燥等纯化步骤，获得了高纯度的R-单酰胺产品，实验室公斤级制备的总体收率大于93%。经Hofmann重排反应，使用制备的R-单酰胺合成了高纯度的S-普瑞巴林。本技术实现了一步酶法替代目前S-普瑞巴林合成中污染严重的多步化学拆分，同时保持了原化学路线的高原子经济性优势。该酶法催化步骤可直接嵌入目前的化学合成工艺，无需进行大的工艺条件变动即可实现S-普瑞巴林的化学-生物耦合催化合成，显著提升了过程绿色指数，具有较好的经济性。
上述研究已申请国内发明专利1项，相关结果发表在Green Chemistry期刊，题为“Desymmetric hydrolysis of prochiral imide for S-pregabalin synthesis by rationally designed D-hydantoinase”。中国科学院微生物研究所于波研究员为通讯作者，微生物所刘菲霞助理研究员和中国农业科学院植物保护研究所任杰博士为共同第一作者；中科院微生物所李德峰团队为该工作的完成提供了重要帮助。
文章链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/GC/D2GC00728B
